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1. 在培養(yǎng)類器官時，為什么要盡量避免類器官貼壁？
答：培養(yǎng)類器官培養(yǎng)時，在基質(zhì)膠的支撐下，細(xì)胞可維持3維結(jié)構(gòu)生長。成為一個個三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，并以此模擬體內(nèi)的生長環(huán)境。此時若是類器官貼壁生長，則基質(zhì)膠無法良好地達(dá)成對細(xì)胞的支撐作用。而貼壁生長的細(xì)胞所分化形成的細(xì)胞團(tuán)，不僅無法良好地模擬體內(nèi)的生長環(huán)境，同時產(chǎn)生不同的組織特性，難以重現(xiàn)器官的生理功能。
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2. 種板后為什么要倒扣培養(yǎng)板進(jìn)行孵化？
答：在基質(zhì)膠孵育時倒扣細(xì)胞可以較好地避免細(xì)胞貼壁，同時若膠比較稀時細(xì)胞會因重力緣故沉底。倒扣培養(yǎng)板可使細(xì)胞不沉底避免細(xì)胞貼壁導(dǎo)致的無法形成良好的類器官結(jié)構(gòu)。翻轉(zhuǎn)過程不可用力過猛，以免基質(zhì)膠受力貼壁。
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答：EGF：表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子，對調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化起著重要作用。EGF可提高細(xì)胞內(nèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，也可促進(jìn)一些與增殖有關(guān)的基因表達(dá)，如myc、fos等
R-spondin-1：：R-spondin(Rspo) 是近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋白家族，包括4個成員 (Rspo1~4)。已報道Rspo蛋白家族所有成員均為分泌性蛋白，均有兩個富含半胱氨酸的furin-like結(jié)構(gòu)域、1個TSP1結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端區(qū)域。Rspos通過激活并協(xié)同Wnt/β-catenin信號通路參與對細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，影響骨骼、肌肉、血管等組織的發(fā)育以及肢體和性腺的形成，并在多種疾病的發(fā)生過程中起重要作用。
FGF:成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast Growth Factors，F(xiàn)GFs）它們調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的遷移、增殖、分化、存活、代謝活動和神經(jīng)功能。
Wnt3a：Wnt3a是Wnt信號通路的重要組成之一，屬于依賴β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的經(jīng)典Wnt信號通路，Wnt信號通路在胚胎發(fā)育，細(xì)胞生長、分化，以及腫瘤發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。
Noggin：蛋白質(zhì)Noggin是在發(fā)育中起關(guān)鍵作用的骨形態(tài)遺傳蛋白（BMP）的一種由體內(nèi)分泌出的抑制劑。
VEGF：血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），又稱血管通透因子（vascular permeability factor，VPF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用。
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答：我們知道類器官是一種在體外利用成體干細(xì)胞培養(yǎng)出的三維細(xì)胞培養(yǎng)物，與人體器官具有相似的組織學(xué)特征，并且能部分重現(xiàn)器官的生理功能。而在類器官重現(xiàn)目標(biāo)器官組織學(xué)特性與生理功能前，必不可少的就是對類器官分化的誘導(dǎo)。
在進(jìn)行類器官培養(yǎng)前，我們需要知道該器官的發(fā)育過程以及其發(fā)育相關(guān)的信號通路。并通過添加細(xì)胞因子的方式對相應(yīng)的信號通路進(jìn)行激活或抑制，以達(dá)到該器官在體內(nèi)的信號通路效果。因此在類器官培養(yǎng)中因子使用、信號通路激活/抑制的正確與否，是能否重現(xiàn)器官組織學(xué)特性和生理功能的關(guān)鍵。例如心臟類器官中的WNT和BMP通路，腦類器官醋酸視黃醇誘導(dǎo)眼睛類器官。
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5. 小鼠小腸類器官隱窩結(jié)構(gòu)黑色部分是什么？為什么會出現(xiàn)這樣的結(jié)構(gòu)？
答：小鼠小腸隱窩腔內(nèi)黑色部位是死亡的內(nèi)皮細(xì)胞聚集形成的。這是因?yàn)轭惼鞴賰?nèi)部缺乏循環(huán)系統(tǒng)。因此類器官尺寸較大時靠近中心的細(xì)胞難以和外界進(jìn)行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。類器官結(jié)構(gòu)尺寸越大，死亡的細(xì)胞就越多。如果能將類器官與血管類器官相結(jié)合形成內(nèi)部循環(huán)系統(tǒng)，就能以此培養(yǎng)出尺寸更大的類器官。這也是一個研究方向。
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答：大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次，有些類器官可以連續(xù)傳代20次，并且維持原有的生長速度。
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7. 什么時候?qū)︻惼鞴龠M(jìn)行傳代？
答：類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時間判斷。一般在7-14天時進(jìn)行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次。
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8. 培養(yǎng)過程中類器官培養(yǎng)物中的黑色小顆粒是什么？應(yīng)該怎樣去除？
答：黑色小顆粒大概率是雜質(zhì)或細(xì)胞碎片，去除時可先將類器官消化下來，用培養(yǎng)基進(jìn)行反復(fù)清洗，達(dá)到稀釋雜質(zhì)的作用。
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9. 小鼠肝膽管類器官傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)
答：1、類器官分離類器官與基質(zhì)膠時，使用類器官解離液。類器官在解離液中時間一般不可超過3分鐘。在解離液中浸泡時間過長，將導(dǎo)致類器官生長情況差甚至直接收到破壞失去活性。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，小塊細(xì)胞的混合物，可以觀察到由10-50個細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，消化就完成了。
2、重新進(jìn)行基質(zhì)膠3D包裹時，基質(zhì)膠占比也應(yīng)在70%以上。
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10. 類器官模型與二維細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別
答：傳統(tǒng)培養(yǎng)時，二維細(xì)胞平鋪于培養(yǎng)皿底部，分泌因子直接進(jìn)入培養(yǎng)基中，難以形成細(xì)胞的旁分泌。細(xì)胞間作用力微弱。而培養(yǎng)基中的物質(zhì)無差別作用于每個細(xì)胞。在一些藥物測試時，藥物進(jìn)入培養(yǎng)基后常常會對細(xì)胞進(jìn)行無差別的殺死。難以模擬實(shí)際體內(nèi)藥物作用過程。
類器官在基質(zhì)膠包裹下，基質(zhì)膠支撐著細(xì)胞生長，形成立體結(jié)構(gòu)。在特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)下向不同方向分化生長。外部養(yǎng)分進(jìn)入培養(yǎng)基后，基質(zhì)膠與類器官外圍細(xì)胞會像體內(nèi)情況一樣具有屏障作用。營養(yǎng)物質(zhì)滲透形成濃度梯度。細(xì)胞代謝產(chǎn)物、分泌因子，形成局部微環(huán)境。模擬體內(nèi)環(huán)境。
