Organoid Cryopreservation Medium（Serum Free）
類器官凍存液
? 分裝后的類器官培養(yǎng)基需儲(chǔ)存于2-8 ℃，有效期兩年
1、 產(chǎn)品描述
?；镱惼鞴賰龃嬉骸?span>Organoid Cryopreservation Medium（Serum Free）】可應(yīng)用于多種哺乳動(dòng)物（如人、鼠、豬、蝙蝠、牛等）來源的類器官和細(xì)胞系的低溫長期保存，該凍存液不含血清，不含任何動(dòng)物來源成分，含有10%DMSO。
2、 產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
存儲(chǔ)/運(yùn)輸 |
保質(zhì)期 |
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類器官凍存液 |
MB-0818L02L |
100 mL |
2-8 °C |
24個(gè)月 |
3、 其他自備材料和試劑
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
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上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 |
MB-0818L07 |
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類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液 |
MB-0818L03L / MB-0818L03S |
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類器官消化液 |
MB-0818L01L |
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類器官回收液 |
MA-0837DS001 |
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模基生物基質(zhì)膠分裝預(yù)冷盒 |
AB-YL1005 |
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胰蛋白酶溶液 |
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磷酸鹽緩沖液 |
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細(xì)胞凍存管 |
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細(xì)胞培養(yǎng)皿 6/10cm |
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4、 類器官或細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
a) 類器官的凍存
1、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：觀察類器官狀態(tài)，代次為3~5代最佳，避免選擇已分化、代次過大進(jìn)行凍存。若是狀態(tài)較差，可更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至類器官狀態(tài)良好時(shí)凍存。準(zhǔn)備好細(xì)胞凍存程序降溫盒置于室溫平衡溫度。以下步驟與細(xì)胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。
2、 凍存前處理：選擇類器官生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)孔，在保留原培養(yǎng)液的條件下（或者吸去培養(yǎng)液加入等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基），用細(xì)胞刮刀或者移液器尖端輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5ml或15ml離心管中，吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，100~300g離心3分鐘。若還有基質(zhì)膠可用預(yù)冷基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗幾次，盡量去除基質(zhì)膠，避免細(xì)胞無法與凍存保護(hù)液充分接觸，或者按照說明書使用類器官回收液去除基質(zhì)膠。
注：在凍存體積過大的或者是多層上皮的/鱗狀細(xì)胞組成的類器官時(shí)，由于這類結(jié)構(gòu)緊密，難以使用機(jī)械力分散，可使用類器官消化液適當(dāng)消化5~15分鐘再使用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次后進(jìn)行凍存。
3、 添加凍存液：向準(zhǔn)備凍存的類器官中加入500~1000μL預(yù)冷的凍存液（1×10?個(gè)/mL），吹打混勻后迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管中。
4、 程序降溫和長期保存：將低溫凍存管放入細(xì)胞凍存程序降溫盒內(nèi)，隨后迅速將細(xì)胞凍存程序降溫盒放入-80℃超低溫冰箱中，24小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮（-196℃）中長期保存。也可將凍存管進(jìn)行人工梯度降溫處理，如4℃靜置10min，-20℃保存1小時(shí)，-80℃保存過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。
b) 細(xì)胞的凍存
1、 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。
2、 細(xì)胞收集：
2.1、貼壁細(xì)胞：吸棄舊培養(yǎng)液，使用PBS潤洗細(xì)胞后再加入適量胰蛋白酶溶液把單層生長的細(xì)胞消化下來，加入完全培養(yǎng)基終止消化，收集于離心管中離心，1000rpm，3min。
2.2懸浮生長的細(xì)胞則直接收集于離心管中離心，1000rpm，3min。
3、 離心后去除上清液，加入適量預(yù)冷的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度在5×10?-1×10?/mL之間。
4、 添加凍存液：向準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞中加入500~1000μL預(yù)冷的凍存液（1×10?個(gè)/mL），吹打混勻后迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞凍存管中。
5、 程序降溫和長期保存：將低溫凍存管放入細(xì)胞凍存程序降溫盒內(nèi)，隨后迅速將細(xì)胞凍存程序降溫盒放入-80℃超低溫冰箱中，24小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮（-196℃）中長期保存。也可將凍存管進(jìn)行人工梯度降溫處理，如4℃靜置10min，-20℃保存1小時(shí)，-80℃保存過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。
c) 類器官或細(xì)胞的復(fù)蘇
1、 提前在37℃條件下預(yù)熱類器官或細(xì)胞所需的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
2、 在37℃的水浴中快速解凍細(xì)胞凍存管，當(dāng)凍存管內(nèi)凍存物僅剩些許冰渣殘留時(shí)立即停止水浴并及時(shí)轉(zhuǎn)移至潔凈操作臺(tái)。
3、 將凍存懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，緩緩加入5-10倍體積的預(yù)熱的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻。
4、 將上步驟所獲類器官或細(xì)胞懸液進(jìn)行離心（水平離心轉(zhuǎn)子，150-300g，3min），棄上清，再次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸類器官或細(xì)胞沉淀。
5、 將上步驟所獲類器官或細(xì)胞懸液進(jìn)行離心（水平離心轉(zhuǎn)子，150-300g，3min），棄上清后所獲類器官或細(xì)胞可用于后續(xù)類器官或細(xì)胞的培養(yǎng)。
V2.0版
更新時(shí)間：2025/6/21
