Human Liver Ductal Organoid Kit Plus（Expansion）
人肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝Plus（擴(kuò)增）
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1、 產(chǎn)品描述
?；锶烁文懝茴惼鞴倥囵B(yǎng)基套裝Plus（擴(kuò)增）【Human Liver Ductal Organoid Kit Plus（Expansion）】是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)從成體干細(xì)胞衍生的人肝膽管類器官。肝膽管的自我更新上皮細(xì)胞是由位于肝臟的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞的擴(kuò)增所驅(qū)動(dòng)的。肝膽管類器官因其上皮在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動(dòng)力學(xué)方面的表現(xiàn)，而具有真實(shí)器官的特征。肝膽管類器官可以在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出肝樣細(xì)胞，為人類肝臟發(fā)育和疾病的研究提供了前所未有的模型。
2、 產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
存儲(chǔ)/運(yùn)輸 |
保質(zhì)期 |
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人肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝Plus（擴(kuò)增） |
MA-0817H008HLP |
500mL |
-20°C |
24個(gè)月 |
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MA-0817H008HSP |
100mL |
3、 其他自備試劑和耗材
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
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?；锝鹋苹|(zhì)膠 |
082701/082703/082755 |
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上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 |
MB-0818L07 |
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類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液 |
MB-0818L03L / MB-0818L03S |
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組織消化液 |
MB-0818L06L |
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紅細(xì)胞裂解液 |
MB-0818L08L / MB-0818L08S |
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活組織細(xì)胞保存液 |
MB-0818L04L |
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類器官消化液 |
MB-0818L01L |
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?；锘|(zhì)膠分裝預(yù)冷盒 |
AB-YL1005 |
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胎牛血清 |
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磷酸鹽緩沖液 |
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細(xì)胞過濾器100μm |
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細(xì)胞培養(yǎng)板 96/48/24/12/6 孔 |
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離心管 1.5/5/15/50mL |
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細(xì)胞培養(yǎng)皿 6/10cm |
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4、 人肝膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）使用說明
1、 收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進(jìn)行解凍；
2、 待培養(yǎng)基完全解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺(tái)中根據(jù)日常需求量進(jìn)行分裝，推薦分裝成10mL/管；
3、 分裝后的培養(yǎng)基請(qǐng)密封后儲(chǔ)存于-20℃，使用時(shí)取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。
5、 人肝膽管類器官的建立與傳代培養(yǎng)
注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。
a) 原代人肝膽管類器官的建立
1、 原代組織樣本應(yīng)在離體5min內(nèi)放入裝有預(yù)冷的活組織保存液（2-8℃）的樣本管中，樣本需要被活組織保存液完全覆蓋（如果樣品已經(jīng)放在其他緩沖液或培養(yǎng)基中，請(qǐng)用預(yù)冷的活組織保存液替換整個(gè)溶液）。低溫（2~8℃）運(yùn)輸轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。
2、 實(shí)驗(yàn)前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時(shí)取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細(xì)胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。
3、 在潔凈工作臺(tái)中，將樣本轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含雙抗的DPBS沖洗組織兩次。
4、 使用鑷子將組織轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在冰上用無菌的組織剪將組織剪碎為0.5~2mm2大小。
5、 將剪碎的組織用50倍組織體積的組織消化液重懸，并轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫?fù)u床中，水平振蕩消化15-30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時(shí)，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多活細(xì)胞團(tuán)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不完全可適當(dāng)延長消化時(shí)間。消化期間可以使用不同規(guī)格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時(shí)，消化過程即完成。
6、 將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細(xì)胞過濾器過濾。
7、 收集濾液并在4℃下以250g離心3分鐘。在可見的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入1mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，并在4℃下以250g離心3分鐘。如紅細(xì)胞過多可重復(fù)此步驟。
8、 吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟以完全去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。
9、 吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細(xì)胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意：混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過程。大約10,000個(gè)細(xì)胞應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因?yàn)檫@可能會(huì)抑制固體液滴的正確形成。
10、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正中央，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。
注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會(huì)在試管或移液器吸頭中凝固。
11、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。
12、 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。
注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。
13、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。
14、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基。
15、 密切監(jiān)測(cè)類器官生長狀態(tài)，理想情況下，人肝膽管類器官應(yīng)在7-14天內(nèi)建成。
b) 人肝膽管類器官的傳代培養(yǎng)
1、 待類器官培養(yǎng)到直徑為500μm大小時(shí)（或變黑不再增大時(shí)），即可進(jìn)行類器官的傳代（每代約1~2周）。以下操作與細(xì)胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：
2、 吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀或者移液管吸頭尖端輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。
3、 去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化5~10分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成小的細(xì)胞團(tuán)塊，消化不充分可適當(dāng)延長消化時(shí)間。若要求細(xì)胞計(jì)數(shù)則需消化成單個(gè)細(xì)胞，可延長消化時(shí)間至10~20分鐘后終止消化后臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時(shí)間最短。
4、 消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應(yīng)，然后250g離心3分鐘。
5、 吸棄上清液，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。最后一次清洗可將類器官合并收集在同一個(gè)離心管中。
6、 清洗完成后將離心沉淀中的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。
注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
7、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正中央，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。
8、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。
9、 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。
注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。
10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基。密切監(jiān)測(cè)類器官生長狀態(tài)，直到類器官需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
V2.0版
更新時(shí)間：2025/6/12
