腸隱窩是小腸上皮絨毛根部下陷至固有層形成的管腺體，開口于相鄰絨毛間。上皮層向固有層內(nèi)陷形成的無數(shù)隱窩中存在著維持上皮細(xì)胞不斷更新?lián)Q代的干細(xì)胞，通過增值分化維持小腸穩(wěn)態(tài)修復(fù)上皮損傷。
2009年荷蘭的Toshiro Sato ，Robert G.Vries等人分離小腸隱窩體外模擬腸上皮的增值分化過程，建立了既可長期培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞又維持了細(xì)胞原始分化能力的新型培養(yǎng)方法。為干細(xì)胞研究、疾病模型建立、再生藥物研究開啟了新的大門。
作為各種研究的基礎(chǔ)—小鼠小腸類器官培養(yǎng)卻成了許多學(xué)者老師們頭疼的問題，操作難、培養(yǎng)不易、隱窩太少等等都妨礙著許多學(xué)者老師在各自擅長領(lǐng)域大展身手。經(jīng)過兩次實(shí)驗(yàn)直播以及直播后的交流，相信大家對我們的培養(yǎng)方式有了一定的了解。正所謂工欲善其事必先利其器，基質(zhì)膠在類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中起著著至關(guān)重要的作用。
為了讓大家了解基質(zhì)膠，選擇合適、優(yōu)秀的基質(zhì)膠。今天我們?yōu)榇蠹規(guī)砹四；|(zhì)膠批次202223706ZWD、20223708ZWD以及進(jìn)口C品牌批次2010005的對比實(shí)驗(yàn)。
一.
樣本信息
?；|(zhì)膠
| 名稱 | 貨號 | 批號 | 濃度（mg/mL） |
| 類器官專用基質(zhì)膠 |
082755/0827555 |
20223708ZWD | 8.78 |
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類器官專用基質(zhì)膠 |
082755/0827555 |
20223706ZWD |
9.33 |
對照組
| 廠家 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 批號 |
| c品牌 | 高濃度無酚紅基質(zhì)膠 | 356231 |
2010005
|
二.
實(shí)驗(yàn)流程
1.培養(yǎng)材料
（1）試劑：MatrigengeL Matrix、小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒、類器官消化液、潤洗液、基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
（2）耗材：48孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管（規(guī)格為1.5mL）、移液器（規(guī)格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規(guī)格為10μL、200μL和1000μL）、40μm細(xì)胞過濾器。
2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
（1）MatrigengeL Matrix 4℃化凍
（2）小鼠膽管類器官完全培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement C(250x)加至9.76mL Mouse Liver Ductal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠膽管類器官完全培養(yǎng)基，室溫平衡，可在2-8°C儲存，建議在兩周內(nèi)使用。
3.類器官培養(yǎng)
以下操作吹打細(xì)胞的吸頭均需用潤洗液潤洗后使用：
（1）小鼠膽管類器官收集：保留原有培養(yǎng)液，用移液管吸頭尖端輕輕刮下吹打細(xì)胞外基質(zhì)和小鼠膽管類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，吹打5~10次，使小鼠膽管類器官和細(xì)胞外基質(zhì)分離，300g離心3分鐘。
（2）小鼠膽管類器官消化：離心后，去除上清液，分別加入200μL類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化。
（3）小鼠膽管類器官終止消化：類器官消化時(shí)間5分鐘，吹打混勻，加入1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應(yīng)，300g離心3分鐘。
（4）細(xì)胞過濾：加入1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用40μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，收集濾液至新的離心管中，300g離心3分鐘。
（5）小鼠膽管類器官清洗：離心后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗1次收集至同一個(gè)離心管中，離心以去除殘留的消化液。
（6）細(xì)胞計(jì)數(shù)：用1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取18μL細(xì)胞懸液與2μL臺盼藍(lán)混勻，取10μL混合液加至血球計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),300g離心3分鐘，棄上清。
（7）基質(zhì)膠3D包裹：根據(jù)密度加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取5 μL細(xì)胞懸液至新的離心管中，每組分別與18μL不同的細(xì)胞外基質(zhì)冰上混勻（注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。
（8）種板培養(yǎng)：用移液器吸取10μL細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合液移至培養(yǎng)板孔中，混合懸液須點(diǎn)在培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁，平行2孔。將培養(yǎng)板放入37℃，在5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20分鐘，待細(xì)胞外基質(zhì)凝固至不再流動(dòng)后，沿孔壁緩緩加入250 μL完全培養(yǎng)基。
（9）持續(xù)培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察小鼠膽管類器官的生長狀態(tài)，于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個(gè)視野中類器官的形態(tài)和分布。
三.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
四.
實(shí)驗(yàn)分析
?；|(zhì)膠與Brand C基質(zhì)膠均有良好的培養(yǎng)效果，兩組實(shí)驗(yàn)?zāi)懝茴惼鞴倬鶡o明顯貼壁現(xiàn)象。其中20224105CWD的培養(yǎng)效果略勝一籌。
模基生物基質(zhì)膠經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)檢驗(yàn)證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩(wěn)定性好、低內(nèi)毒素、無污染。在購買?；a(chǎn)品時(shí)，根據(jù)用戶個(gè)性化的需求對用戶進(jìn)行最佳產(chǎn)品、貨號的推薦，以便用戶獲得性價(jià)比最高、效果最優(yōu)的產(chǎn)品。
五.
參考資料
1.膽管“類器官”修復(fù)受損肝臟試驗(yàn)成功——首證實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞可助器官移植（中國科學(xué)院官網(wǎng)）
2.Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver（science官網(wǎng)）
