Calf Intestine Organoid Kit Plus
牛小腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus
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1、 產(chǎn)品描述
模基生物牛小腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus（ Calf Intestine Organoid Kit Plus）一款用于建立和維持牛小腸道成體干細(xì)胞來(lái)源的小腸類器官培養(yǎng)基套裝?？奢^大程度維持小腸隱窩的活性，并提升小腸類器官的形成率，所培養(yǎng)的牛小腸類器官主要由小腸干細(xì)胞、快速擴(kuò)增細(xì)胞、腸吸收細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，牛小腸類器官能部分重現(xiàn)腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機(jī)制研究的理想體外模型。
2、 產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
存儲(chǔ)/運(yùn)輸 |
保質(zhì)期 |
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牛小腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus |
MA-0817H012LP |
500mL |
-20°C |
24個(gè)月 |
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MA-0817H012SP |
100mL |
3、 其他自備試劑和耗材
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
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?；锝鹋苹|(zhì)膠 |
082701/082703/082755 |
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上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 |
MB-0818L07 |
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類器官培養(yǎng)防粘附潤(rùn)洗液 |
MB-0818L03L / MB-0818L03S |
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組織消化液 |
MB-0818L06L |
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紅細(xì)胞裂解液 |
MB-0818L08L / MB-0818L08S |
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活組織細(xì)胞保存液 |
MB-0818L04L |
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類器官消化液 |
MB-0818L01L |
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模基生物基質(zhì)膠分裝預(yù)冷盒 |
AB-YL1005 |
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胎牛血清 |
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磷酸鹽緩沖液 |
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細(xì)胞過(guò)濾器100μm |
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細(xì)胞培養(yǎng)板 96/48/24/12/6 孔 |
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離心管 1.5/5/15/50mL |
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細(xì)胞培養(yǎng)皿 6/10cm |
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4、 使用說(shuō)明牛小腸類器官完全培養(yǎng)基使用說(shuō)明
1、 收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進(jìn)行解凍；
2、 待培養(yǎng)基完全解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺(tái)中根據(jù)日常需求量進(jìn)行分裝，推薦分裝成10mL/管；
3、 分裝后的培養(yǎng)基請(qǐng)密封后儲(chǔ)存于-20℃，使用時(shí)取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。
5、 牛小腸類器官的建立與傳代培養(yǎng)
a) 原代牛小腸類器官的建立
1、 實(shí)驗(yàn)前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時(shí)取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細(xì)胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用。
2、 取樣：在無(wú)菌條件下取出牛小腸組織，放入4℃預(yù)冷的上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含雙抗的DPBS中，清洗組織2次。
3、 使用鑷子將組織轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在冰上用無(wú)菌的組織剪將組織剪碎為0.5~2mm2大?。軌蛲ㄟ^(guò)10mL移液管的尖端）。注：以下操作與細(xì)胞接觸的耗材均需用潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用。
4、 將清洗后的組織用50倍組織體積的組織消化液重懸，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫?fù)u床中，水平振蕩消化30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時(shí)，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多膽管結(jié)構(gòu)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不完全可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。消化期間可以使用不同規(guī)格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過(guò)1mL移液器吸頭時(shí)，消化過(guò)程即完成。
5、 將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，使用100μm的細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)，過(guò)濾收集上清，4℃下以250g離心3分鐘。
6、 在可見(jiàn)的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入2mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細(xì)胞1分鐘，并在4℃下以250g離心3分鐘。（可選做）
7、 吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟以完全去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。
8、 吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細(xì)胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意：混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。
注：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過(guò)程。大約10,000個(gè)細(xì)胞應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中或50個(gè)管狀結(jié)構(gòu)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過(guò)度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因?yàn)檫@可能會(huì)抑制固體液滴的正確形成。
9、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正中央，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。
注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會(huì)在試管或移液器吸頭中凝固。
10、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。
11、 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。
12、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。
13、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基。
14、 密切監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下，牛小腸類器官應(yīng)在7-14天內(nèi)建成。
b) 牛小腸類器官的傳代培養(yǎng)
1、 用經(jīng)過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭吹打刮取類器官，并將牛小腸類器官和培養(yǎng)基懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的1.5mLEP管中。
2、 用經(jīng)過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與基質(zhì)膠分離。
3、 300g，4℃離心3min，棄上清，用經(jīng)過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭加入200μL類器官消化液并充分混勻，37℃條件下消化1-3min，消化結(jié)束后加入1mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻。
4、 300g，4℃離心3min，棄上清，再次加入1mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基并混勻。
5、 300g，4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。
6、 用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò)30s以避免基質(zhì)膠過(guò)早凝固。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
7、 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30μL左右。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。
8、 將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固后取出。
9、 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿孔壁加入提前預(yù)熱的牛小腸類器官完全培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。
10、 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
V2.0版
更新時(shí)間：2025/7/28
