Human Colonic Organoid Kit Plus（Expansion）
人結(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus（擴(kuò)增）
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1、 產(chǎn)品描述
?；锶私Y(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus（擴(kuò)增）【Human Colonic Organoid Kit Plus (Expansion) Plus】是一款用于擴(kuò)增人結(jié)腸類器官的完全培養(yǎng)基，擴(kuò)增時(shí)的人結(jié)腸類器官主要由結(jié)腸干細(xì)胞和結(jié)腸祖細(xì)胞組成。結(jié)腸類器官在自我更新和分化能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，重現(xiàn)了體內(nèi)結(jié)腸上皮的特征，因此是人結(jié)腸研究的理想體外模型。
2、 產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
存儲(chǔ)/運(yùn)輸 |
保質(zhì)期 |
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人結(jié)腸類器官培養(yǎng)基套 裝（擴(kuò)增）Plus |
MA-0817H001HLP |
500mL |
-20°C |
24個(gè)月 |
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MA-0817H001HSP |
100mL |
3、 其他自備試劑和耗材
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
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?；锝鹋苹|(zhì)膠 |
082701/082703/082755 |
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上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 |
MB-0818L07 |
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類器官培養(yǎng)防粘附潤(rùn)洗液 |
MB-0818L03L / MB-0818L03S |
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活組織細(xì)胞保存液 |
MB-0818L04L |
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類器官消化液 |
MB-0818L01L |
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?；锘|(zhì)膠分裝預(yù)冷盒 |
AB-YL1005 |
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牛血清白蛋白 |
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磷酸鹽緩沖液 |
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青霉素-鏈霉素混合液 |
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EDTA(0.5M,pH8.0) |
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細(xì)胞過(guò)濾器100μm |
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細(xì)胞培養(yǎng)板 96/48/24/12/6 孔 |
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離心管 1.5/5/15/50mL |
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細(xì)胞培養(yǎng)皿 6/10cm |
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4、 人結(jié)腸類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）使用說(shuō)明
1、 收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進(jìn)行解凍。
2、 待培養(yǎng)基完全解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺(tái)中根據(jù)日常需求量進(jìn)行分裝，推薦分裝成10mL/管。
3、 分裝后的培養(yǎng)基請(qǐng)密封后儲(chǔ)存于-20℃，使用時(shí)取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。
5、 人結(jié)腸類器官的建立與傳代培養(yǎng)
注意：涉及原代人體組織材料的研究必須遵守所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得 所有受試者的知情同意。
a) 原代人結(jié)腸類器官的建立
1、 原代組織樣本應(yīng)在離體5min內(nèi)放入裝有預(yù)冷的活組織保存液（2-8℃）的樣本管中，樣本需要被活組織保存液完全覆蓋（如果樣品已經(jīng)放在其他緩沖液或培養(yǎng)基中，請(qǐng)用預(yù)冷的活組織保存液替換整個(gè)溶液）。低溫（2~8℃）運(yùn)輸轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。
2、 實(shí)驗(yàn)前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時(shí)取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細(xì)胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用。
3、 在潔凈工作臺(tái)中，將樣本轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，評(píng)估獲得的組織是否完全由上皮組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請(qǐng)?jiān)诮馄曙@微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒(méi)有脂肪或肌肉組織，請(qǐng)立即繼續(xù)下一步。
4、 將組織樣本轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)冷含雙抗DPBS的培養(yǎng)皿中，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面粘液或殘留的糞便，接著將結(jié)腸組織置于新的含雙抗DPBS的培養(yǎng)皿中清洗2-3次。將清洗后的腸組織剪碎至約2mm*5mm大小，隨后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，劇烈震蕩30s(垂直上下震蕩20次一上一下算一次，約1s三次)棄上清，重復(fù)3次。
5、 消化：加入30mL的DPBS溶液中再加入300μL 0.5M EDTA，至EDTA終濃度為5mM。置4℃搖床上，80rpm，消化20~30min（視樣本量而定，可在消化20分鐘時(shí)吹打混勻后鏡下觀察消化情況，若觀察到完整的隱窩結(jié)構(gòu)即可進(jìn)行下一步操作）。
6、 清洗：消化完成后，靜置待腸段沉淀，棄上清。加入預(yù)冷DPBS，輕柔搖勻，靜置后棄上清，重復(fù)2次以去除EDTA。
7、 重懸：加入30mL預(yù)冷的含0.1%BSA的DPBS，渦旋10s，取上清100μm濾網(wǎng)過(guò)濾，收集穿過(guò)濾網(wǎng)的組織懸液，重復(fù)收集2次。
8、 收集：300g離心力4℃離心3min。
9、 吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，取懸液進(jìn)行隱窩計(jì)數(shù)。
10、 300g離心力4℃離心3min，吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細(xì)胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意：混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過(guò)程。大約50個(gè)隱窩應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過(guò)度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因?yàn)檫@可能會(huì)抑制固體液滴的正確形成。
11、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正中央，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。
12、 注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會(huì)在試管或移液器吸頭中凝固。
13、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。
14、 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。
15、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。
16、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基。
17、 密切監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)。
b) 人結(jié)腸類器官的傳代培養(yǎng)
1、 待類器官培養(yǎng)到直徑為600μm大小時(shí)（或變黑不再增大時(shí)），即可進(jìn)行類器官的傳代（每代約1周）。以下操作與細(xì)胞接觸的耗材均需用潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用：
2、 吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀或者移液管吸頭尖端輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過(guò)大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。
3、 去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化3分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成300μm左右類器官團(tuán)塊。
注：一下步驟重懸沉淀需要控制吹打力度及次數(shù)，是類器官團(tuán)塊控制在大小300μm左右。
4、 消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕柔吹打混勻以終止消化反應(yīng)，然后250g離心3分鐘。
5、 吸棄上清液，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。最后一次清洗可將類器官合并收集在同一個(gè)離心管中。
6、 清洗完成后將離心沉淀中的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
7、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正中央，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。大約50個(gè)類器官團(tuán)塊接種在25μL基質(zhì)膠中。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。
8、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。
9、 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。
10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。
11、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官完全培養(yǎng)基。
12、 密切監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)，直到類器官需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
V2.0版
更新時(shí)間：2025/6/12
