NeuroCortex Inducer Kit
NeuroCortex series 皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)試劑盒
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? 產(chǎn)品是無菌的，產(chǎn)品外包裝是非無菌的，請在使用前對產(chǎn)品外包裝充分消毒。 ? 產(chǎn)品一經(jīng)拆封，應(yīng)妥善存放以確保產(chǎn)品的無菌性。 ?對要進行誘導(dǎo)的PSC進行干性檢測，如SSEA-3/4+OCT4，對神經(jīng)上皮誘導(dǎo)的2D細胞也可進行表征IF鑒定驗證神經(jīng)上皮分化，如SOX2+ OCT4+ Nestin+ Nanog-。 |
1、 產(chǎn)品描述
NeuroCortex系列皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)試劑盒是?；镒灾餮邪l(fā)的前腦腹側(cè)化信號通路調(diào)控技術(shù)，專為模擬人腦皮質(zhì)發(fā)育及功能研究設(shè)計的標準化培養(yǎng)體系。該體系通過時序激活Wnt/β-catenin及梯度抑制BMP/Smad信號，驅(qū)動人源多能干細胞（PSC）定向分化為高純度谷氨酸能神經(jīng)元（VGLUT1/2陽性率>85%），并同步誘導(dǎo)放射狀膠質(zhì)細胞（Pax6+/BLBP+）形成仿生腦室區(qū)結(jié)構(gòu)。可在60天內(nèi)穩(wěn)定生成直徑1.5-2.0 mm的層狀皮質(zhì)類器官，其特征性表達深層皮質(zhì)標志物TBR1（第Ⅴ-Ⅵ層）及表層SATB2+神經(jīng)元（第Ⅱ-Ⅳ層），并伴隨MBP+/MOG+少突膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的致密髓鞘化（LFB染色陽性率>70%）。該體系通過三維旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器或超低粘附孔板中（3D-RBC，氧梯度維持在8-12%）實現(xiàn)高通量培養(yǎng)（單批次≥96個類器官）。本模型適用于神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默癥tau蛋白病理建模）、精神分裂癥NMDA受體功能解析及自閉癥譜系障礙突觸可塑性研究，同時兼容單細胞測序和鈣成像動態(tài)追蹤技術(shù)。
2、 產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
試劑盒組分 |
規(guī)格 |
試劑盒組分貨號 |
存儲/運輸 |
保質(zhì)期 |
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NeuroCortex series 皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)試劑盒 |
ML-0827N01 |
NeuroEpithelial Induction Medium 神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基 |
100mL |
ML-0827N01A |
-20°C |
24個月 |
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Neurosphere Formation Medium 神經(jīng)球形成培養(yǎng)基 |
100mL |
ML-0827N01B |
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Neural Rosette Expansion Medium 神經(jīng)蓮座擴張培養(yǎng)基 |
100mL*2 |
ML-0827N01C |
3、 其他自備材料和試劑
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
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干細胞金牌基質(zhì)膠 |
082777 |
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NeuroCortex series 皮質(zhì)腦成熟培養(yǎng)基 |
ML-0827N02 |
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StemGrowth series 水解酶溫和消化液 |
ML-0827S03 |
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StemGrowth series多能干細胞金牌培養(yǎng)基 |
ML-0827S04 |
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StemGrowth series 抗脅迫補充劑 1000x |
ML-0827S10 |
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StemGrowth series 消化液 |
ML-0827S08 |
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超低黏附96孔u底板 |
ML-0827P12 |
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超低黏附6孔培養(yǎng)皿 |
ML-0827P13 |
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8-12通道排槍 |
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4、 ?；锿扑]用細胞系
H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者來源DY043、iPSC-EGFP等
5、 新手須知
NeuroCortex series 腦類器官誘導(dǎo)試劑盒理論上可以形成至少100個腦類器官，但是建議第一次誘導(dǎo)以1個六孔板啟動分化形成至少60-100個均一大小神經(jīng)上皮球（理想形成率60%）。
注意事項：在使用時應(yīng)始終穿戴防護服，在處理諸如人體細胞或其他生物及有害物質(zhì)時應(yīng)遵循安全的實驗室規(guī)程。
僅用于科學(xué)研究。
6、 使用說明
a) 實驗用品
基質(zhì)膠、干細胞完全培養(yǎng)基、皮質(zhì)腦類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基、超低黏附u底板/超低黏附6孔培養(yǎng)皿6孔培養(yǎng)皿其他類器官培養(yǎng)所需試劑、耗材；）
b) 使用程序：
b.1、PSC細胞培養(yǎng)及神經(jīng)上皮干細胞NESC的二維誘導(dǎo)
1、 根據(jù)不同PSC細胞系的特性從ESC＜60P、iPSC＜50P中復(fù)蘇一支細胞、經(jīng)過兩次高質(zhì)量傳代記作復(fù)蘇后P3（干細胞培養(yǎng)操作見StemGrowth series / StemGrowth UniMediX GoldenHold Medium培養(yǎng)SOP）
2、 PSC傳代后兩天進行神經(jīng)上皮誘導(dǎo)，觀測細胞形態(tài)成小島狀克隆，細胞克隆密度低于30%、無單細胞脅迫生長樣及應(yīng)激態(tài)球狀克隆團即可進行誘導(dǎo)。棄去干細胞培養(yǎng)基使用DMEM/F12潤洗兩次細胞去除漂浮細胞后每孔加入2mL神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2天換液一次，直到細胞克隆密度達到80%, 10x顯微鏡下觀測克隆邊緣圓潤光滑、細胞核縮小且變多，誘導(dǎo)時間計3-4天。
注意！PSC克隆出現(xiàn)問題、自分化及漂浮的情況應(yīng)再啟動復(fù)蘇擴增一株，不可直接用于分化
b.1.1、從EB球直接神經(jīng)上皮誘導(dǎo)（新手建議此方法進行分化)
1、 根據(jù)不同PSC細胞系的特性從ESC/＜60P、iPSCs＜50P中復(fù)蘇一支細胞、經(jīng)過兩次高質(zhì)量傳代記作復(fù)蘇后P3（干細胞培養(yǎng)操作見StemGrowth series多能干細胞金牌培養(yǎng)基提供的PSC培養(yǎng)SOP）。
2、 將PSC細胞培養(yǎng)至80% 的克隆密度、克隆邊界清晰圓潤、細胞核質(zhì)比正常即可進行EB誘導(dǎo)，DPBS洗滌細胞兩遍后使每孔用500μL的StemGrowth series 水解酶溫和消化液或StemGrowth series 消化液，消化6-10分鐘，觀測克隆變圓皺縮變亮、搖晃可見少量細胞脫離基質(zhì)即可終止消化。
3、 吸棄消化液，如若使用水解酶消化導(dǎo)致細胞大量漂浮則不吸棄，使用等量的StemGrowth series多能干細胞金牌培養(yǎng)基終止消化。而無酶體系的StemGrowth series 消化液則吸棄后直接每孔加入500μL StemGrowth series EBs 形成培養(yǎng)基重懸細胞后收集于15mL或50mL離心管中（根據(jù)消化液種類靈活選擇）。
4、 水解酶消化后的細胞120g離心5分鐘棄除上清后，加入按消化的孔數(shù)*500μL 的體積加入EBs形成培養(yǎng)基重懸并補充1000x到1x的StemGrowth series 抗脅迫補充劑，而無酶體系的StemGrowth series 消化液 消化后的細胞直接加入原重懸體系的（消化孔數(shù)*500μL）的體積的EBs培養(yǎng)基后補充1x的StemGrowth series 抗脅迫補充劑。
5、 將細胞懸浮液+ 1x StemGrowth series 抗脅迫補充劑加入加樣槽中或10cm細胞培養(yǎng)皿，使用排槍每孔100μL加入超低粘附96孔u底培養(yǎng)皿中，封口膜包好后水平甩板機1500rpm離心5分鐘，37度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第二天每孔加入100μL EBs(不含StemGrowth series 抗脅迫補充劑)形成培養(yǎng)基，EB形成總時間約48小時。
6、 第三天完全吸棄EBs形成培養(yǎng)基，每孔加入200μL神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)三天，第二天吸棄100μL再補液100μL去除培養(yǎng)代謝廢物。
b.2、神經(jīng)球形成（直接從EB誘導(dǎo)神經(jīng)上皮的方法不參考此步驟)
1、 將6mL StemGrowth series 水解酶溫和消化液預(yù)熱至室溫后，放入生物安全柜，每孔使用1mL的DPBS洗滌誘導(dǎo)的神經(jīng)上皮干細胞兩次，每孔加入800μL-1000μL的StemGrowth series 水解酶溫和消化液，放入培養(yǎng)箱消化5-8分鐘，每4分鐘觀測一次細胞狀態(tài)，細胞克隆邊緣卷起、細胞間隙變亮且有少量細胞漂浮于消化液中即可終止消化。
2、 從側(cè)壁處吸棄消化液，每孔加入1mL的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基重懸細胞后定容于12mL的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基+12 μL的StemGrowth series 抗脅迫補充劑，如若細胞消化過度大部分完全飄起則使用每孔1mL的DMEM/F12終止消化后120g/3min離心收集細胞后定容于12 mL的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基+12μL StemGrowth series 抗脅迫補充劑，注意:定容前臺盼藍染色檢測細胞活性高于80%即可進行下一步操作。
3、 準備2個超低黏附96孔u底板，使用排槍每孔100μL細胞懸液加入孔中，封口膜包好后96孔板水平離心機 1500rpm/5min離心。
4、 離心結(jié)束細胞應(yīng)聚集于孔的一側(cè)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后每孔再次加入100μL的神經(jīng)球形成培養(yǎng)基不含StemGrowth series 抗脅迫補充劑，神經(jīng)球形成誘導(dǎo)時間計2天。
5、 對于直接形成EB后誘導(dǎo)神經(jīng)上皮的體系，完成3天的誘導(dǎo)后完全吸棄神經(jīng)上皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基每孔加入250μL神經(jīng)球形成培養(yǎng)基誘導(dǎo)2天。
b.3、神經(jīng)蓮座擴張(兩種方案一致）
1、 當(dāng)神經(jīng)球直徑達到相關(guān)標準時（200-600μm），使用寬口200μL移液槍頭吸出神經(jīng)球于超低吸附6孔板中，每個孔最多容納10個神經(jīng)球，所以最少準備2個六塊板啟動神經(jīng)蓮座擴張。
2、 神經(jīng)球進入6孔板中后，輕柔的每孔加入2mL神經(jīng)蓮座擴張培養(yǎng)基后，放入十字/旋轉(zhuǎn)搖床80rpm/s上培養(yǎng)18天，每1-2天換液一次/每孔換液2mL。
b.4、皮質(zhì)腦成熟
當(dāng)神經(jīng)球中心和外側(cè)出現(xiàn)黑色的斑點狀結(jié)構(gòu)說明神經(jīng)蓮座擴張到適合階段，完全棄去神經(jīng)蓮座擴張培養(yǎng)基每孔加入2mL的皮質(zhì)區(qū)腦成熟培養(yǎng)基放入十字/旋轉(zhuǎn)搖床80rpm/s上培養(yǎng)18-26天/每2-3天換液一次即可用于鑒定和下游實驗。成熟的腦類器官結(jié)構(gòu)上IF染色可見TUJ1/SOX2標記的細胞形成VZ和SVZ樣的結(jié)構(gòu)，且高表達谷氨能相關(guān)基因，使用腦成熟培養(yǎng)基長期于搖床培養(yǎng)可以培養(yǎng)至120天中心細胞不出現(xiàn)凋亡。
當(dāng)皮質(zhì)腦培養(yǎng)至直徑大于1mm以上時，需對其進行切割減少內(nèi)部細胞凋亡的情況。使用鋒利無鈍口的2號手術(shù)刀片將一個1mm以上的皮質(zhì)腦類器官切割成2-4塊，DPBS洗滌一遍類器官后，使用寬口1000μL移液槍頭轉(zhuǎn)移至15mL離心管中自然沉降（約需要5-8min），吸棄DPBS上清后，加入神經(jīng)蓮座擴張培養(yǎng)基+1x StemGrowth series 抗脅迫補充劑轉(zhuǎn)移入超低粘附六孔板80rpm/s 培養(yǎng)4天，每天換液。4天后加入更換為皮質(zhì)區(qū)腦類器官成熟培養(yǎng)基120rpm/s 繼續(xù)維持培養(yǎng)，可延長培養(yǎng)時間和類器官活性至180天。
V1.3版
更新時間：2025/09/03
